本文的内容

1.拟南芥的瞬时转化。2.最常见的变异模式。3.如何用化学方法进行菌种诱变实验？4.什么是诱变育种？本文论述了试诱变育种的一般过程。拟南芥

拟南芥瞬时转化

EMS诱变引起的突变往往不是单点。当然，如果按照正常的步骤走，也不会有太多的突变点，基本处于可控状态。一般来说，我们会收获经过EMS诱变的植物的种子，这样所有的突变体都存在于这些种子中。然后我们需要做的是从这些种子中选择具有特定性状的所需突变体。有各种筛选方法，不赘述。如果运气好的话，你会得到一个突变体，具有你想要的性状，而这个突变体的性状是由单个基因控制的。是的，这个突变体是由单个基因控制的。这个基因由于EMS突变而断裂，所以表现出你想要的性状。但是在该突变体中可能有10个、20个甚至更多的突变位点——。其他突变发生在与你关心的性状无关的位置。比如我曾经筛选过重瓣的拟南芥，后来发现它的后代有想要的性状3354，尽管不是重瓣。这说明重瓣的基因突变只是副作用。为什么我们认为EMS在拟南芥中诱变时总是单一位点？奥秘在于后来的遗传手段。当然，我们首先要做的是确定这个突变是不是由单个基因引起的(以前只是假设)。这是一个非常简单的基因实验。将突变体与野生型拟南芥杂交得到F1代，然后将F1代自交，根据突变体筛选标准检测F2代的分离比例。如果前面的假设是正确的，你会发现大约1/4的植物表现出突变体表型，另外3/4表现出野生型表型。当然也不一定是1:3，3:1，13360233601。也可以接受3354。遗传学家从孟德尔开始就很熟悉这个了，我就不解释了。这里的结果一般不会出现在纸上，所以想找张图来说明，结果也失败了。然而，EMS筛选突变体是一个必要的步骤。我电脑里也有当年的照片，但一时找不到了。如果基因检测通过，我们就开始大量杂交不同背景的野生型突变体(比如Col-0和L er，或者只在我们实验室常用的C24和L er)，做图位克隆(这个太复杂不相关，我就不赘述了)，同时开始反复回交。是的，反复回交很重要。& quot回交& quot这里所说的实际上是指将突变体与野生型杂交，然后在F2代筛选出表型后代，再与野生型杂交，然后在F2代筛选出表型后代，再重复这个过程……虽然拟南芥世代在植物中的时间很短，但第一代仍然需要两三个月，所以这是一个非常耗时和耐心的工作。但是，这样做仍然是有意义的，因为它已经稀释了突变体的& quot血统& quot。经过反复杂交，除了我们的目的突变之外，基因组的其他大部分其实已经被野生型基因组取代了。在这样的后代中，我们几乎可以认为EMS诱导的突变位点只有一个。之所以要清理背景，其实是因为其他基因突变会影响植物的表型。比如我的双瓣卡那霉素抗性拟南芥，控制双瓣拟南芥表型的，其实不是我感兴趣的基因表达的。如果不清理，一方面对于研究来说没有意义，另一方面可能会给后来的研究者带来不必要的混乱(当然我自己的话，种子青黄的时候，用一些重瓣的拟南芥赶实验，对结果不会有什么影响)。当然，在今天的论文中，从EMS诱变到获得特定的突变位点和突变植株，往往只是一句话，根本不涉及我上面说的基因工作。所以如果对实验过程不了解，真的很容易产生& quot只有一个突变& quot。

请满意地接受它。

最常见的突变方式

T-DNA是根癌农杆菌天然质粒Ti上的一段DNA，能自发转移并插入植物染色体DNA。T-DNA插入植物染色体的位置是随机的。如果T-DNA被插入到某个功能，特别是外显子区域，就会造成基因功能的丧失。

甲基磺酸乙酯(EMS)是一种化学诱变剂，能直接作用于DNA鸟嘌呤引起的点突变和染色体损伤。其诱变效果远高于电离辐射和自发诱变，是目前应用最广、效果最好的。EMS技术创造的突变材料表现出形态、生理、生化和抗病变异，是研究基因及其功能的良好材料。

索尔克研究所基因组分析实验室

索尔克生物研究所是一个非营利性的科研机构，位于美国加利福尼亚州圣地亚哥的拉霍亚。它由脊髓灰质炎疫苗开发者乔纳斯索尔克于1960年创立。创始顾问之一是雅各布布朗诺斯基和弗朗西斯克里克。直到1962年春天才开始建设，就生命科学领域的研究成果和质量而言，该研究所一直是美国顶尖的机构之一。2004年，& quot泰晤士高等教育增刊& quot将索尔克列为世界顶级生物医学研究所，在2009年，& quot科学观察组织& quot将索尔克研究所的神经科学和行为领域列为世界第一；至少有11位诺贝尔奖获得者在索尔克生物研究所工作或培训过。

在想为什么这里会提到索尔克研究所？

">用化学法如何进行菌种诱变实验

已知的有烷化剂、碱基类似物(base analog)、羟胺(hydroxylamine)、吖啶色素等。
常用化学诱变剂的种类及作用机制
（一）烷化剂
是栽培作物诱发突变的最重要的一类诱变剂。药剂带有一个或多个活泼的烷基。通过烷基置换，取代其它分子的氢原子称为"烷化作用"所以这类物质称烷化剂。
烷化剂分为以下几类：
1. 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐
代表药剂：甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）
2. 亚硝基烷基化合物
代表药剂：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU）
3. 次乙胺和环氧乙烷类
代表药剂：乙烯亚胺（EI）
4. 芥子气类
氮芥类、硫芥类
烷化剂的作用机制–烷化作用 作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。
（二）核酸碱基类似物
这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。
代表药剂：
5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR） 为胸腺嘧啶（T）的类似物
2-氨基嘌呤（AP） 为腺嘌呤（A）的类似物
马来酰肼（MH） 为尿嘧啶（U）的异构体
作用机制：作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。
（三）其它诱变剂
亚硝酸 能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA复制紊乱。HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。
叠氮化钠(NaN3) 是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，而且无残毒。
以下是具体的使用方法，希望对你有点作用！！！！！！！！！！
化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。
化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能宜接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防上污染环境，造成公害。
一、碱基类似物
用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5－IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的给、结构类似物。最常用是5－BU和AP。
当将这类物质加人到培养基中，在繁殖过程中可以掺人到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，困此，也叫掺人诱变剂。显然这一类诱变剂要求微生物细胞必顿处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。
（一）碱基类似物的诱变机制
正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。
5-BU 导致A：T碱基对转换为GC碱基
2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中A：T－ G：C或G：C－ A：T的转换。
（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）
1．单独处理
将微生物液体培养到对数期．离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液．饥饿培养8-10h，消耗其体内的贮存物质、将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25-40ug／ml，温合均匀．取0.1-0.2ml菌悬液加人到琼脂培养基上涂布培养。在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理。培养后挑取单菌落，进行筛选。如果是处理真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度，常处理浓度为 0.1mg／ml。
2．与辐射线复合处理
据报道；如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗人到DNA分予中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用射线要好。因此碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂。从而提高突变率。
二、烷化剂
（一）烷化剂的作用机制
烷化剂分单功能烷化剂和双功能或多功能烷化剂两大类。前者仅一个烷化基团，对生物毒性小，诱变效应大。后者具有两个或多个烷化基团，毒性大，致死率高，诱变效应较差。主要原因是双功能烷化剂有硫芥、氮芥。
烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占烷化作用的10％左右。因此，由这些位点改变所引起的突变仅是少数。
烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂，而造成突变。
（二）烷化剂的性质
溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生分解。它们大部分半衰期很短，其长短与温反、溶液PH关系很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。 有毒！！！！
（三）常用的烷化剂
亚硝基胍（NTG）
黄色晶体物质，性质不稳定，容易光解，黄色变为绿色时，诱变效应际低。
有超诱变剂之称，常用缓冲溶液有磷酸缓冲液和Tri缓冲液。
诱变处理方法：
①用一定值的磷酸缓冲液或Tri缓冲液洗制成菌悬液。②NTG母液：配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲液，其比例为缓冲液9ml：NTG丙酮溶液lml，浓度为NTG 1mg/ml ；使用时取母液0.2ml + 菌悬液1.8ml，NTG终浓度为100ug/ ml。一般随菌种不同而异，细菌一般为100-1000 ug/ ml，放线菌、真菌为l000-3000 ug/ ml。③放线菌在生长适宜的温度下培养，（细菌30-35℃、真菌25-28℃、放线菌30-32℃）处理若干时间，一般细菌20-60min,孢子90-120 min④终止反应。冷的生理盐水50倍稀释处理，或经过离心洗涤处理，作一定稀释度分离于平皿。如果是细菌，把后培养基按一定浓度加入到菌体沉淀物中，振荡培养1.5-2h，经2-3次细胞分裂，再涂平皿。
处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH浸泡处理。
NTG除以上直接以溶液处理外，还可以按以下方法诱变处理，摇瓶振荡处理：在接菌后的培养基中加人5-10 ug/ ml NTG．并加几滴吐温60或吐温80，使成乳化状（注意吐温对该菌生长是否有影响）；在平皿上生长过程处理：如果将NTG、琼脂和菌体混合制成平板，NTG浓度为10-50 ug/ ml。或将琼脂培养基制成平板．然后将NTG和菌体混合涂抹平析，此时NTG浓度为10-20 ug/ ml。
经后培养的培养液．除部分进行平皿分离外。剩余的培养液可以加人适量的药物，保存于冰箱内数天。如日本有人把经过NTG处理后的大肠杆菌培养液，用50％甘油（最终浓度为12.5％）于-40℃、-80℃保存。在以后数天内随时可取出融化，稀释分离，突变体死亡很少。
据报道．无论是用辐射处理，还是用化学诱变剂处理后的菌悬液或后增养液，浸在冰浴中2-3h，试验的重复性很好。认为在大肠杆菌、枯草杆菌和放线菌等可以采取这一措施来提高诱变效果。
NTG是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例用自来水大量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜，洗净。
2．甲基磺酸乙酯（简称EMS）
甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于水，不稳定，易水解成无活性物质。
EMS的诱变处理方法：
① EMS 母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。
②取新鲜的菌体，经前培养至对数期．离心洗涤，用缓冲液制成8 ml菌悬液（107-108ml-1）。对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，悬液含 106 ml-1。
③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌悬液中。在适宜温度下处理一定时间（根据预实验绪果确定）。处理的最终浓度为0 .lmol／L。对于真菌孢子，则为0.2-0.5rnol／L。
④EMS处理一定时间后，用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次离心、洗涤，以终止反应。
EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。
三、脱氨剂
亚硝酸是一稀常用的诱变剂，毒性小．不稳定，易挥发．其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO和NO2
（一）亚硝酸的诱变机制
脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。A→H，C→U，G→X。 A：T→G：C和G：C→A：T。亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。
亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，DNA复制，从而导致奕变。
（二）亚硝酸的处理方法
1．试剂的配制
（1）1mol／L pH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol／L亚硝酸钠溶液
（3）0.07mol／L pH8.6磷酸氢二钠溶液
以上试剂用前均要灭菌。
2．处理方法
取孢子悬液1 ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液lml，最后处理浓度为0.025 mol／L ；25-26℃保温10-20min，加入的磷酸氢二钠溶液 20 ml，使出下降至pH 6. 8左右，以终止反应。稀释分离于平板。
如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05 mol／L。
在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。
四、移码诱变剂
移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。它们主要包括吖啶黄、吖啶橙、ICR－171、ICR-191等。移码诱变剂对噬菌体有强烈的诱变作用，诱发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更为显著。如某些产生抗生素的放线菌。用处理后，发现产量明显下降，主要就是由于控制抗生素合成的质粒脱落造成的。
吖啶黄的性质和使用方法：
淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，见光易分解。
使用时，先用少许乙醇溶解，配成一定浓度的母液。通常处理方法是特它们加入培养基中，使最后浓度为10-50ug/ml，混合后制成平板，适温培养，在生长过程中处理。另外还可将吖啶黄加人到培养液中，浓度为10-20 ug/ml ，在适温条件下，振荡培养过程中处理。
五、羟化剂【以羟胺为例】
羟胺的简称HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性。
1.羟胺的诱变机制
当羟胺浓度为0.1-1.0mol／L pH6.0时，主要与胞嘧啶反应，使羟化的C与A配对，在0.1-1.0mol／L pH9.0，羟胺可以与鸟嘧啶反应，10-3 mol／L时，羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。但据分析，羟胺与T、G反应的是它的产物，而不是它本身。此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氯，也具有诱变作用。
2．羟胺的处理方法
常用浓度为0.1％-5％，可直接在溶液中处理，时间1-2h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中。然后接入孢 子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理．所用浓度比直接处理时低些。
六、金属盐类
用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。其中氯化理比较常用，与其他诱变剂复合处理，效果相当显著。
氯化锂称之为助诱变剂，氯化锂是白色粉末，易溶于水，使用时通常加到培养基中。
为了速免受破坏．倒平板时，当培养基温度冷却到50-60℃时才加入制成平板，然后把细菌或孢子涂布分离，处理终浓度为0.3％-1.5%。
七、其他化学诱变剂
1．秋水仙素
秋水仙碱是诱发细胞染色休多倍体的诱变剂。秋水仙碱的主要作用是破坏细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成。导致多倍体的产生。
2．抗生素
作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素、争光霉素、丝裂霉素、放线菌素、光辉霉素和阿霉素等。这些抗生素都是抗癌药物，它们在微生物育种中虽有应用，但效果不如烷化剂等诱变剂显著，应用并不广泛。一般不单独使用，常与其他诱变剂一起复合使用。
八、直视化学诱变剂的操作安全
化学诱变剂多数是极毒的致癌药品，在进行诱变操作后的处置以及诱变剂的保藏等方面的安全防护都是极其重要的。如有疏忽，就可能对健康和环境带来恶果，万万不可麻痹。

何谓诱变育种?试论述诱变育种的一般流程

人为地利用物理、化学等因素诱导生物发生遗传性的变异，依据育种目标选择培育新品种的方法叫诱变育种。按照引起变异的因素不同，又可分为物理诱变和化学诱变两种。

物理诱变是利用超声波、高温、激光、各种射线等物理因素诱导生物发生变异的方法，其中应用最广的是辐射育种。

一、辐射育种

辐射育种是用放射线对植物种子、幼苗、花粉或营养体进行照射，使之发生遗传性变异，经人工选择培育新品种的方法。

辐射育种的射线，按其性质可分电磁波辐射和粒子辐射两大类。前者常用的有X射线、γ射线和无线电微波等；后者，带电的有α、β射线，不带电的有中子。上述各种射线中，以中子射线的诱变率最高，β射线次之，γ射线和X射线更低。但由于射线来源、设备条件及安全等多种原因，目前最常用的还是γ射线。

辐射之所以能引起变异，是因为生物体受到电离辐射，其体内的分子或原子也直接或间接地发生电离和激发，生物组织中的化学键可发生断裂，从而使分子结构或化学活性发生改变。有些射线如中子等还能和一些元素产生核反应，或者由于放射性元素的衰变而产生新的元素加入到有机体内改变了原有分子的组成。再者，生物细胞内的大量水分，在电离作用下，产生强烈的氧化还原反应，使新陈代谢发生变化，从而产生变异。

（一）药用植物辐射育种的发展概况

自从1895年伦琴发现X射线，1896年贝克勒尔发现天然放射性物质以后，生物工作者开始用电离辐射对微生物、昆虫和药用植物进行研究。1921年Blakesles首先用射线照射曼陀罗（Datura stramonium L.）的种子，获得了各种形态上的突变型。70年代以后Michalski用20kR剂量的γ射线照射毛花洋地黄（Digitalis lanata Ehrh.），获得了毛花样地黄有效成分含量高的品系。Parimoo用X射线处理罗芙木（Rauwolfia serpentina Benth.）的种子，所得突变体生物碱含量特别高。Deril等用γ射线照射一叶萩（Securinega ramiflora Muell.-Arg.）的种子，选育出了高产的一叶萩突变品系。Getsadze用10—11kR的γ射线照射香罗勒（Ocimum gratissimum L.）的种子得到的突变体，不但具有高精油含量，而且具有抗尖镰孢菌的能力。

我国的辐射育种开始于1957年，目前全国几乎每个省、市、自治区都安装了60Co-γ射线源，有的还安装了137CS源、中子源和γ圃，为辐射育种提供了物质基础，并取得了一定的成绩。例如，用提纯的紫皮阿城大蒜为材料，用60Co-γ射线照射，育成了阿辐4号大蒜新品种，其蒜头平均鲜重是对照品种的2倍以上，不仅抗病耐贮，而且提前成熟8天。四川省中药研究所用CO2激光照射薏苡种子，育成四激薏78—1号新品种，具有植株矮、分蘖多、千粒重大等优点。其它药用植物如人参、元胡等的辐射育种工作已经开始。

（二）辐射的剂量单位和照射剂量

1.辐射的剂量单位

居里（Ci）

是表示放射性物质的放射强度单位，1Ci表示放射性同位素每秒钟有3.7×1010次核衰变。

克镭当量

是放射物放出的γ射线强度一定重量的镭放出γ射线强度之比所得的放射强度单位。

伦琴（R）

是只用于X射线和γ射线的照射单位，它表示入射的辐射量。在1g空气中能产生83Gy的射线能量即为1R。

拉特（rad）

是任何辐射都适用的单位。它表示被照射物吸收剂量的单位。任何1g被照射的物质吸收照射能100Gy时的剂量称为1rad。

积分流量

即单位平方厘米的中子数（中子数/cm2）。中子的单位一般用它或用拉特来表示。

2.辐射的剂量

半致死照射剂量

即经过照射后植株成活率占50%的照射量。

致死照射量

即经过照射后，引起植株全部死亡的照射量。

临界照射量

即照射后植株成活率占40%的照射量。一般采用临界照射剂量作为辐射育种的适宜照射量。但也有用“半致死照射量”或更高照射量的。

照射剂量率

表示单位时间内的照射剂量。常用单位为R/h，R/min，R/s。

辐射育种的适宜照射剂量及剂量率随不同植物而异，一般说来十字花科有较高的耐辐射能力，豆科耐辐射能力较低。同一物种中，多倍体比二倍体耐辐射，二倍体比单倍体耐辐射。植物的不同发育阶段其耐辐射能力不同，分裂旺盛的细胞和组织对辐射比老化细胞和组织敏感。细胞核比细胞质敏感。

在一定的照射范围内，突变量随照射剂量的增加而增高，但是损伤效应也随之提高，因此一定要选用适宜的照射剂量和剂量率，以便达到既有较高的突变率又有足够的植株供选择。例如中国医学科学院药用植物资源开发研究所1979—1982年在北京和吉林省集安县国营一参场，经多次试验摸索出用60Co-γ射线照射人参裂口种子，在50R/min剂量率下，照射剂量以1500—2000R为好。在此剂量下出苗率为对照的83.3%和37.5%，一年生幼苗的叶片几乎都有不同程度的变异。正常情况为三小叶，照射后多变为一小叶、二小叶、长尾叶或很不规则的三小叶，有的叶面凸出，有的叶缘缺刻，有变异的植株占出苗株数的79%以上（表8—3）。试验表明，高于10000R不出苗，低于500R叶片的变异率很低。

表8—3 人参种子用60Co-γ射线照射试验

（三）辐射育种的基本方法

1.辐射材料的选择辐射育种是在常规育种的基础上发展起来的新技术，因此对材料的要求应该高些。辐射育种最适于改变一、二个不良性状，只有选用综合性状优良、需要克服的缺点明确的材料，才能收到预期的效果。

2.辐射的处理方法

（1）外照射

用X射线、γ射线和中子照射植物的种子、花粉、子房及营养器官。

（2）内照射

其方法有多种。

①将82P、35S等放射性同位素配成适当比强的溶液浸泡种子或营养器官。

②将放射性同位素施放于土壤中，让植物吸收。

③将放射性同位素溶液注射到植物的有关部位。

④供给植物带14C的CO2，将14C同位素同化到代谢产物中去。

⑤将放射性同位素通过一定方式贴在植物的花芽或生长点上，使之产生芽变。

采用上述方法需要一定的防护设备，严防放射性物质的污染。处理过的材料不能食用或饲用。

3.辐射后代的选育

辐射育种的选择方法和杂交育种大致相同，但由于辐射后代遗传特性和杂种后代不完全一样，因此后代的处理方法也有区别。

（1）辐射一代的处理

辐射后代一般用M表示，辐射的一、二、三代分别用M1、M2、M3表示；也可用射线名称的第一个字母表示，如用X1、γ1、n1分别表示X、γ、中子照射的第一代。

由于M1代的性状多呈隐性不能表现出来，因此一般不进行选择。如果人力、物力不足，可一株留一至数粒种子，但供M2代选择的个体一般情况下不能少于1000株。

（2）M2代的选择

M2代是分离最大的一个世代，能遗传的变异大多在M2代表现出来，因此M2代应大量选择单株，淘汰不良的个体。

（3）M3代的选育

M3代仍有分离，但分离较小，因此M3代以选择优良系统为主，在优良系统中可继续选单株，供下一代继续鉴定评选。

（4）M4代以后性状基本稳定，以后的选育程序同常规育种。

（5）辐射营养器官的选育

无性繁殖的药用植物，其遗传基础大多是异质结合的，辐射变异一经发生M1代就表现出来，因此M1代就要选择，以后继续无性繁殖不会发生分离。但是无性繁殖的器官如果发生了变异，细胞分裂较慢，生活力弱，生长发育不如正常细胞，为了给变异细胞创造生长发育的良好条件，可采用多次剪顶芽、剪侧枝的办法，促使变异茎部多长侧枝，然后将其扦插或嫁接繁殖，以增加选择的机会。

二、化学诱变育种

（一）发展概况

某些化学药剂有诱导遗传变异的作用，早在1910年就有过少量的研究。1911年麦克顿高尔（Mcdongl），1916年鲍尔（Baur），1936年萨哈洛夫（Sacharov）等人都发现化学物质能提高动植物的突变率，但在植物中一般认为利用化学物质诱发突变的工作应从约克斯（Oehlkers）1943年用乌来糖（Urethane脲烷）诱发月见草、百合及风铃草染色体畸变的工作开始。

药用植物上的化学诱变育种在70年代才发展起来。Kaul等用0.025%和0.05%的次乙亚胺处理颠茄种子所得的突变体植株高，分枝多，产量显著提高，生物碱含量提高47.3—72.7%。Kohgpatehko用0.05%的亚硝基乙基脲（NEU）处理欧茜草（Rubia tinctorum L.）的种子获得了根中蒽醌衍生物的含量比对照组增加0.38%的品系。Arinshtein用亚硝基甲基脲（NMU）在欧丹参（Salvia sclarea L.）上诱发出早开花、迟开花、单位叶面积油腺多、抗病强等各类突变体。还获得了适于机械化收获的重衣草及高产精油的蔷薇突变体。

（二）常用的药用植物育种化学诱变剂

近年来化学诱变剂的发展很快，只要浓度适当，化学药品诱发的突变率较高。加之化学药品较各种射线源容易得到，且使用方便，故应用者较多。

目前在药用植物育种中主要使用烷化剂，它们都有活跃的烷基，借助于磷酸基、嘌呤基的烷化，与DNA或RNA起作用，引起基因的突变。例如，硫芥的产物能在DNA双螺旋的两条链之间形成“交联”，阻止DNA双链的分开，妨碍正常复制的进行而导致遗传密码的改良。常用的化学诱变剂有以下几类：

1.芥子气类，如氮芥类、硫芥类的许多化合物。

2.次乙亚胺（EI）、环氧乙烷。

3.烷基磺酸盐类和烷基硫酸盐类，如甲基磺酸乙烷（EMS）、乙基磺酸乙烷（EES）、硫酸二甲酯（DMS）、硫酸二乙酯（DES）、硫酸甲乙酯（MES）等。

4.亚硝基烷基化合物，如亚硝基甲基脲（NMU）、亚硝基乙基脲（NEU）等。

农作物上使用的种类尚有与核酸类似的碱基化合物、简单的无机化合物、各种麻醉剂、抗生素及某些中草药中的高分子化合物如长春花碱、石蒜碱等。

（三）化学诱变的处理方法

植株的各部分都可用适当的方法进行处理，处理最多的是种子，其次是营养器官。植株的处理可将劈开一半的茎插入含有诱变溶液的管子内使它慢慢吸收，或者用棉团把诱变剂溶液引入植物体内，还可注射或涂抹在植物器官内外。当归的同源四倍体就是选用储存越冬中等大小的栽子，用刀片纵切栽子顶端中部3—5mm至顶端生长点，然后浸于0.01%富民农溶液中浸泡72小时诱导而成。

种子处理一般用浸泡法。药剂浓度和浸泡时间对不同药剂及不同处理对象来说是不同的，一般都要通过试验找出最佳条件。

花粉的处理可在密闭系统内，把花粉铺成单层用诱变剂蒸汽进行熏蒸。

使用化学诱变剂一定要小心谨慎，有些是致癌物，切忌接触皮肤或吸入体内，并防止环境污染。

三、多倍体育种

多倍体育种是诱变育种中使细胞染色体加倍以后，再经选择培育而成为新品种的方法。自从1937年有人首先利用秋水仙素处理曼陀罗一举获85%的四倍体以来，药用植物的多倍体育种得到了蓬勃的发展。我国药用植物资源丰富，多倍体育种具有广阔的前景，目前已获得牛膝和当归的多倍体。

（一）多倍体的概念

各种生物的染色体数目是相对稳定的，任何植物的细胞染色体数与该物种的染色体基数（X）呈倍数性关系。一般植物体细胞的染色体数目为染色体基数的2倍，称为“二倍体”；染色体数目为基数的3倍或3倍以上的称为“多倍体”。配子细胞的染色体因减数分裂而减半，因此体细胞染色体数目是配子细胞染色体数目的2倍。通常用X表示物种的染色体基数，n表示配子细胞的染色体数。2n表示体细胞的染色体数。例如曼陀罗的染色体n=x=12，2n=2x=24。当归的染色体n=x=11，2n=2x=22。染色体多倍化的现象广泛存在于植物界，被子植物中有一半以上是多倍体。目前栽培的经济作物大多数为多倍体。药用植物的多倍体也不少，例如分布在北美的委陵菜属中就存在这种以种的形式发生的多倍化系列，区域委陵菜（Potentilla finifima 2n=2x=14）是二倍体；宾洲委陵菜（P.pensylvanica 2n=4x=28）为四倍体；二回羽状委陵菜（P.bripinnatifida 2n=8x=56）为八倍体。据观察，我国药用元胡的染色体也存在多倍化系列，全叶延胡（Corydalis repens Mandl.et Muchld.）、齿办延胡索（C.turtschaninovii Bess.）为二倍体，2n=2x=16；延胡索（C.yanhusuo W.T.Wang）夏天无〔C.decumbens（Thunb）Pers.〕为四倍体，2n=4x=32；圆齿办延胡索（C.remota var.rotundiloba Maxim.）为六倍体，2n=6x=48。

在多倍体中，根据染色体组的来源和性质分为同源多倍体和异源多倍体两大类。

1.同源多倍体

染色体组的来源相同，并超过二个染色体组以上的多倍体称为同源多倍体。正常二倍体细胞的染色体加倍以后就成为同源四倍体。同源四倍体和正常的二倍体杂交则可产生同源三倍体。三倍体植物因减数分裂时染色体混乱，不能配对，表现高度不育。

2.异源多倍体

染色体组来源不同，并超过二个染色体组以上的多倍体称为异源多倍体。异源多倍体一般是由不同种属间杂交所产生的杂种再通过染色体加倍而成。

多倍体和二倍体植物相比，在形态和生理上都有许多优点，一般具有较大的细胞和营养器官，抗病力较强，生物合成能力较高，因而有较高的有效成分含量。但并不是染色体增加的倍数越高越好，而是有一定的限度。一般认为三倍体和四倍体有最大的优势。

（二）多倍体育种的应用方式

人们掌握了多倍体形成和控制其发生的规律以后，多倍体育种已成为培育良种的重要手段。目前主要有以下几个方面的应用。

（1）通过远缘杂交，对不孕杂种进行染色体加倍，克服远缘杂种不育不孕性。我国小麦和黑麦杂交培育出世界著名的抗逆性强、产量和蛋白质含量都高的小黑麦新品种，就是一个典型的例子。药用植物澳洲茄两个变种杂交（Solanum aviculare var.albiflorum XS.aviculare var.brisbanense）也获得人工异源多倍体。

（2）将二倍体药用植物诱导成同源多倍体加以利用。例如铃鹿等对曼陀罗（D.stramonium）的腋芽，用秋水仙素进行点滴处理，育成四倍体植株（2n=4x=48），其生药叶重约为二倍体的1.7倍。光岗祐彦对含有消炎作用成分甘菊环的母菊（Matricaria thamomilla 2n=18）育成的四倍体（2n=36）花的大小和有效成分含量上均优于2倍体。由胡椒薄荷诱发出的多倍体（2n=144）品系不但精油含量高，而且抗旱、耐寒、抗病。

我国梁可均等用秋水仙碱诱导的牛膝多倍体和二倍体相比，根肥大，木质化轻，产量高。

（3）利用三倍体的杂种优势及无子性，三倍体植物具有明显的杂种优势，由于不孕而没有种子。经济作物甜菜和无籽西瓜是三倍体应用的典型例子。在药用植物上，Trease等认为在罂粟的各倍性水平中，三倍体含吗啡因的量最高。Jankulov报道毛曼陀罗的三倍体杂种平均生物碱的得率超过二倍体的4倍，四倍体的3倍。

（三）人工诱导多倍体的方法和原则

1.常用药品及使用方法

目前应用最普遍、效果好的多倍体诱变剂是0.05—0.2%的秋水仙素水溶液，其次是0.01—0.03%的富民隆水溶液。秋水仙易溶于水，毒性很大，少量药液进入眼睛会导致失明，应特别小心。秋水仙素诱变的作用在于阻止细胞分裂中期纺锤丝的形成，染色体不能分配到两个细胞中而形成多倍体。富民隆效果好，价格低，容易推广，但不溶于水，使用时可称取纯的药粉1g，倒入25ml丙酮中，放80℃水浴上加热，摇动容器促使溶解，趁热将已溶解的药液倒入1000ml蒸馏水中，不断搅拌即得0.1%富民隆原液，然后稀释到需要的浓度使用。

处理方法一般采用浸渍法，也可用点滴、注射、涂抹、喷雾等方法。

2.人工诱变多倍体的原则

（1）诱变材料

同一类植物，染色体少的比染色体多的种类容易产生多倍体，而且所产生的多倍体在形态和生理上容易表现出优势。已经是多倍体了，进一步多倍化有可能表现不良。因此，宜选择染色体数较少的种类作诱变材料。

（2）处理时间

处理时间长短要根据不同药用植物种类及所处状态而定。处于休眠状态的种子或种栽处理时间宜长，已发芽的种子或生长期的幼苗要适当缩短时间。由于植物的嫩芽或幼根对毒性和缺氧耐受力弱，可在药液中浸泡一段时间（如12小时），在空气中保湿一段时间（如12小时），如此共3—4天效果较好。

（3）处理温度

以植物细胞分裂最适温度下处理为好，如人参裂口种子以10℃左右为好，黄芪、枸杞等以20℃左右为好。在处理后的恢复时期以低温、高湿为宜。

（四）多倍体的鉴定

多倍体的特点是植株、叶片、花器官、花粉粒等都较大，叶片较厚，表皮细胞单位面积内气孔及叶绿体数与二倍体有区别，这些特征都可作鉴别多倍体的依据，但最可靠的方法是观察细胞的染色体数目。

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