泡盛曲霉引起南美白对虾黑鳃的报道

Velmurugan Karthikeyan印度2015

摘要：南美白对虾是养殖最广泛的虾种，和其他虾一样容易感染微生物，进而发病。在本研究中，泡盛曲霉KM434331引起南美白对虾黑鳃，这是在印度泰米尔纳德邦Nagbotinem的Vellapallam的南美白对虾养殖池中首次发现和报道的。泡盛曲霉KM434331分离自患病虾的鳃。此外，还对其形态、培养和系统发育特征进行了鉴定。组织病理学显示其有炎症反应、溶血浸润、被膜变黑，虾鳃内沉积胶原样纤维。此外，泡盛曲霉KM434331引起鳃功能障碍，导致池塘虾慢性死亡。

1、前言

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水产养殖是一项重要的全球经济活动(Kathiresan等人，2012年)，提供了世界三分之一的粮食(粮农组织，2009年)。南美白对虾是重要的经济养殖对虾之一，在许多国家都有养殖，尤其是在东南亚(Alcivar-Warren et al .2007)。为了保证南美白对虾产业的正常运行，在南美白对虾的养殖和生产过程中，应严格控制特定的病原体。然而，贝类和有鳍鱼类的养殖目前正遭受真菌感染(Khoa等人，2005年)。1969年，Hubschman报道了虾Palaemonetes kadiakensis的幼虫感染了水霉菌。黑鳃病首次在美国龙虾上报道(Lightner和Fontaine，1975)。一般来说，黑腮是由镰孢菌引起的。起初，鳃改变颜色，然后它们发展成黑鳃，最终导致受感染物种的死亡(Khoa，2005)。据报道，日本对虾早期的串珠镰孢菌导致其鳃的颜色由不透明的白色变为黑色斑点。另外，串珠镰孢菌分生孢子经肌肉接种，证明能引起对虾黑鳃，导致对虾死亡(Rhoobunjongde等，1991)。实验室中口服虾感染真菌与自然感染虾相似。组织病理学研究表明，在鳃丝中发现菌丝和分生孢子，它们被鳃丝和鳃基础结构上的血细胞所包围。结果证实了口虾蛄的病原体是口虾蛄丛孢菌和枝孢菌这两种无性真菌(Duc等人，2009年)。但没有泡盛曲霉KM434331真菌感染南美白对虾引起黑鳃的报道。因此，本研究首次报道从南美白对虾的黑鳃中分离到泡盛曲霉KM434331。结果表明，泡盛曲霉KM434331在成虾养殖池中感染了南美白对虾的鳃。

2、材料和方法

2.2样品收集

2013年5月至2014年4月，用抛网捕取了12-16g黑鳃南美白对虾。收集30-45只感染的虾，并将每只虾带回实验室进行进一步研究。

2.3组织病理学研究

戴维森固定剂被注射到受真菌感染的濒死虾的肝脏和肌肉中，以防止其自溶。注射后，将整个虾浸泡在戴维森固定液中48小时，然后处理。切下黑鳃，浸泡在戴维森固定液中48小时，然后转移到70%乙醇中进一步处理。此外，切片用苏木精和伊红染色，并在40倍光学显微镜下观察切片以进行常规病理学研究。

2.4微生物研究

从感染真菌的鳃上切下黑色鳃组织，在40倍光学显微镜下观察。用无菌生理盐水(0.85%NaCl)洗涤黑鳃组织三次，然后分离细菌，接种于夏克氏葡萄糖琼脂平板上，用两性霉素B和硫酸链霉素抑制其他细菌的污染。此外，将平板在25培养4天，然后使用25的SDA斜面纯种扩增培养物进行后续实验。真菌菌株经LPCB鉴定，光学显微镜观察其形态。

2.5扫描电子显微镜(SEM)

2.6分子鉴定和系统发育分析

3 结果

3.1显微镜和组织病理学观察

南美白对虾黑鳃的外在临床症状是鳃的外观呈黑色。图1显示光镜下正常的南美白对虾鳃和感染虾鳃的真菌分生孢子被覆在鳃小叶上。图2显示了组织学结果。有正常的和患病的虾腮。病虾鳃的血腔横切面显示鳃片上布满菌丝。而溶血性浸润使大量物质外渗，导致凝固性坏死。

图1 (A)光镜下正常鳃(b)光镜下感染真菌的虾鳃外观。

图2 (A)正常鳃片(b)鳃组织血腔横切面，血细胞被大量凝固坏死物质包围。

3.2微生物研究

SDA平板上的菌落颜色起初是灰色，然后迅速变成明亮的浅绿色。分生孢子的花梗粗糙，长至1毫米，呈散放射状，独立柱状分布。第二层，有的分生孢子头直接连在瓶梗上，里面有小泡。茎为7-102-2.5微米；分生孢子通常呈球形或亚球形，偶尔呈椭圆形，明显粗糙，直径为3-6微米，但大多小于4-5微米(图3)。

图3(a)LPCB观察到的泡盛曲霉KM434331成熟分生孢子的显微照片。(B)LPCB观察显示分生孢子、分生孢子梗和泡盛曲霉KM434331。

3.3扫描电子显微镜

用扫描电镜观察徐

多菌丝，泡盛曲霉KM434331菌落有分生孢子梗和分生孢子
头。分生孢子头通常呈辐射状，分裂成几个规则的列，偶尔柱状头，分生孢子为球形或
亚球形。其表面覆盖了大量的分生孢子和泡盛曲霉KM434331孢子（图4）

图4 （A）许多菌丝、成熟的分生孢子和泡盛曲霉KM434331的分生孢子梗的显微照片。（B）分生孢子覆盖整个分生孢子梗的表面。（C）盛曲霉KM434331孢子的照片。（D）电镜近距离观察盛曲霉KM434331孢子的照片。

　　3.4 系统发育分析
　　真菌泡盛曲霉通过进一步的18S rDNA检测和BLAST同源性分析，结果表明：分离出的casvk5（KM434331）与泡盛曲霉EU821242的相似度极高，为100%。此外，系统进化树分析表明，分离的单系群间分支的差异极小（图5 ）同时，进化树表明A. brasiliensis和A. usamii的亲缘关系较近。

图5 系统进化树显示，泡盛曲霉CASVK5 KM434331和其它曲霉属真菌的亲缘关系。

　　4 讨论
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　　现代集约化水产养殖导致真菌病的感染在全世界的水产养殖业中大量暴发(Karthikeyan and Gopalakrishnan,2014)。本研究首次报道了，泡盛曲霉导致了南美白对虾成虾养殖池塘虾的黑鳃。目前对泡盛曲霉KM434331的分离和鉴别主要是通过形态学、系统发育、扫描电镜 和组织病理分析。泡盛曲霉是最普遍存在的种类，从虾分离的各种泡盛曲霉可占分离出来真菌的22% (Silva et al., 2011)。曲霉属广为人知，是因为它产生的黄曲霉毒素有致癌的可能(Lacaz et al., 2002)。霉菌病是罗非鱼的主要疾病(Olufemi, 1983)。推测这些真菌的感染是通过鱼饲料的污染传染的(Saleem et al., 2012)。腐皮镰刀菌造成网箱养殖龙虾的黑鳃，并且尝试恢复97只感染真菌之后黑鳃的龙虾(Nha et al., 2009)。然而，在日本对虾的黑鳃病变处分离出了串珠镰刀菌(Rhoobunjongde et al., 1991)。2009年Duc报道，口虾蛄的鳃部感染了枝顶孢属和P. oratosquilla两种变形的真菌。虽然，曲霉属被认为是鱼和虾的病原体，但还没有报道过它导致了虾的黑鳃。因此，这是第一次报道，从虾黑鳃的位置分离出了泡盛曲霉KM434331 。
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　　在本研究中，组织病理学表明，泡盛曲霉KM434331产生的致癌毒素，导致鳃部出现黑斑病灶。鳃部血细胞的被包被作用对虾的呼吸系统造成损伤，黑化作用将最终导致虾的死亡。然而，这个病理症状同另一个报道的真菌疾病很相似。里尔的Fe 2+离子吸收反应导致了黑斑病变(Brain and Egusa, 1981)。
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　　SEM表明，泡盛曲霉KM434331菌落包含分生孢子梗、分生孢子头，分生孢子呈球形或亚球形，覆盖整个分生孢子梗表面。这同致病菌泡盛曲霉 BTMFW032相似（Beena et al., 2010）。系统进化树的结果表明，它与以前的泡盛曲霉的相似度为100%i(Basheeretal.,2011)。

　　5 结论
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　　本研究可能是病原菌泡盛曲霉在南美白对虾养殖上的第一份报道。在南美白对虾的养殖过程中，发育不良容易感染疾病。当环境不良，如水源污染、高密度养殖、投料过多时，会感染泡盛曲霉。因此，南美白对虾养殖过程需要更规范、合理。尽管如此，本次调查对南美白对虾养殖中虾感染泡盛曲霉提供的详细的信息。
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　　译者：利洋公司技术部　陈明卫

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